一、試劑準(zhǔn)備：保障活性與適用性

　　1.試劑取出與復(fù)溫

　　按保存條件取放試劑：提前從冰箱取出所需試劑，根據(jù)保存類型差異分步驟復(fù)溫——冷凍組分（如標(biāo)準(zhǔn)品、未稀釋抗體）需在室溫（18-25℃）自然復(fù)溫15-30分鐘（禁止用手捂熱或溫水加速，避免蛋白變性）；冷藏組分（如酶標(biāo)抗體、洗滌液）無需復(fù)溫，直接取用，取出后避免長時間室溫放置（單次不超過30分鐘）。

　　試劑狀態(tài)檢查：復(fù)溫后觀察各試劑外觀——標(biāo)準(zhǔn)品溶液應(yīng)澄清無沉淀，酶標(biāo)試劑無變色（如HRP標(biāo)記抗體應(yīng)為淡黃色，變深或渾濁則失效），底物溶液（如TMB）無顯色或沉淀；若出現(xiàn)異常，需更換新試劑，禁止使用狀態(tài)異常的試劑。

　　2.試劑稀釋與分裝（按需操作）

　　濃縮試劑稀釋：若試劑盒含濃縮洗滌液（如20×PBST）、濃縮封閉液，需按說明書比例用無酶純水或試劑盒配套稀釋液稀釋（如1:20稀釋洗滌液，確保稀釋充分，避免濃度偏差影響洗滌效果）；稀釋后立即使用，剩余稀釋液可2-8℃冷藏保存，3天內(nèi)用完。

　　標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：取復(fù)溫后的γ干擾素標(biāo)準(zhǔn)品，按說明書要求用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制梯度濃度（如0pg/mL、15pg/mL、30pg/mL、60pg/mL、120pg/mL），稀釋過程需使用無菌移液器和無酶離心管，確保每步濃度準(zhǔn)確（梯度標(biāo)準(zhǔn)品是定量計算的核心，濃度誤差會直接導(dǎo)致結(jié)果偏差）。

　　二、樣本準(zhǔn)備：確保樣本合格與預(yù)處理正確

　　1.樣本類型確認(rèn)與收集

　　樣本類型匹配：確認(rèn)待檢測樣本類型（如血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、腦脊液）與試劑盒適配（不同試劑盒針對不同樣本的預(yù)處理方法不同，如血漿需用EDTA或肝素抗凝，禁止用枸櫞酸鈉抗凝），避免使用試劑盒未標(biāo)注的樣本類型。

　　樣本收集規(guī)范：血清樣本需室溫靜置30-60分鐘待凝血，3000rpm離心10分鐘取上清；血漿樣本采集后立即離心分離（避免溶血，溶血會釋放血紅蛋白干擾檢測）；細胞培養(yǎng)上清需去除細胞碎片（3000rpm離心5分鐘），確保樣本澄清無雜質(zhì)。

　　2.樣本預(yù)處理與保存

　　必要預(yù)處理：若樣本中γ干擾素含量過高（超出試劑盒檢測范圍，如＞200pg/mL），需用樣本稀釋液按比例稀釋（如1:10稀釋），并在檢測時記錄稀釋倍數(shù)（計算結(jié)果需乘以稀釋倍數(shù)）；若樣本含蛋白酶（如組織勻漿），需添加蛋白酶抑制劑（試劑盒未提供時需自行準(zhǔn)備），防止γ干擾素被降解。

　　樣本臨時保存：新鮮樣本優(yōu)先立即檢測，若需暫存，血清/血漿樣本2-8℃可保存24小時，細胞培養(yǎng)上清2-8℃可保存48小時；長期保存需-20℃冷凍（避免反復(fù)凍融，建議分裝后保存），檢測前室溫復(fù)溫并離心去除沉淀。

　　三、儀器與耗材準(zhǔn)備：確保設(shè)備正常運行

　　1.核心儀器檢查與校準(zhǔn)

　　酶標(biāo)儀準(zhǔn)備：提前開啟酶標(biāo)儀預(yù)熱（通常預(yù)熱30分鐘），確認(rèn)波長設(shè)置與試劑盒要求一致（如檢測波長450nm，參考波長630nm）；用試劑盒配套的空白對照或標(biāo)準(zhǔn)品進行儀器校準(zhǔn)，檢查吸光度讀數(shù)穩(wěn)定性（同一標(biāo)準(zhǔn)品多次測量，吸光度偏差≤5%），若偏差過大，需調(diào)整酶標(biāo)儀或聯(lián)系售后維護。

　　輔助儀器檢查：確認(rèn)移液器（如10μL、100μL、1000μL）精度（可通過稱量純水驗證，如100μL純水質(zhì)量應(yīng)為100mg±2mg），離心機動平衡正常，恒溫水浴鍋或孵育箱溫度穩(wěn)定在試劑盒要求的孵育溫度（如37℃，溫度波動≤±0.5℃）。

　　2.耗材準(zhǔn)備與處理

　　耗材選擇：準(zhǔn)備無酶、無熱原的離心管（用于樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋）、移液器吸頭（建議使用帶濾芯吸頭，防止交叉污染）、一次性手套（無粉乳膠或丁腈手套，避免手套粉末干擾抗原抗體反應(yīng)）。

　　酶標(biāo)板準(zhǔn)備：取出預(yù)包被酶標(biāo)板，確認(rèn)板孔無破損、無潮解，若為拆封后剩余板，需檢查密封狀態(tài)（確保無受潮）；根據(jù)樣本數(shù)量取出所需板條，剩余板條立即放回密封袋并加入干燥劑，2-8℃冷藏保存。

　　四、實驗環(huán)境與流程準(zhǔn)備：規(guī)避干擾因素

　　1.實驗環(huán)境控制

　　環(huán)境清潔與溫度濕度：實驗臺面需用75%乙醇擦拭消毒（避免灰塵、微生物污染試劑），環(huán)境溫度控制在18-25℃，相對濕度40%-60%（濕度過高易導(dǎo)致試劑潮解，過低易導(dǎo)致樣本蒸發(fā)）；避免在通風(fēng)口或陽光直射處操作（防止試劑活性下降和酶標(biāo)板孔內(nèi)液體蒸發(fā)）。

　　干擾因素規(guī)避：實驗過程中禁止使用含防腐劑（如疊氮鈉）的試劑或耗材（疊氮鈉會抑制HRP酶活性，影響顯色），避免同時操作其他ELISA實驗（防止不同試劑盒試劑交叉污染）。

　　2.實驗流程梳理與預(yù)演

　　流程梳理：根據(jù)試劑盒說明書梳理實驗步驟（如包被→封閉→加樣→孵育→洗滌→加酶標(biāo)試劑→孵育→洗滌→加底物→顯色→終止→讀板），明確每步的時間、溫度要求（如37℃孵育60分鐘，洗滌3次每次30秒），并在實驗記錄紙上記錄各步驟的時間節(jié)點。

　　預(yù)演關(guān)鍵步驟：提前練習(xí)洗滌步驟（使用洗板機或手動加樣槍，確保每孔洗滌液加量一致，避免漏洗或洗滌過度）、底物添加（需快速且均勻，防止各孔顯色時間差異過大），確保操作熟練，減少實驗誤差。